DNA Barcoding    
 

DNA barcoding dei Chrysomelidae dell’area mediterranea

Matteo Montagna
Davide Sassi
Giuseppe Carlo Lozzia
Renee Labee

        Il progetto C-Bar (Chrysomelidae Barcoding) ha come obiettivo la realizzazione di una banca dati di sequenze per coleotteri crisomelidi dell’area Mediterranea (MEDLB) e si sviluppa nell’ambito del consorzio del Barcode of Life Database (BOLD). Il progetto, attivato presso il Laboratorio di Entomologia Molecolare (L.E.M. DIPSA, Università degli Studi di Milano) del prof. Giuseppe Lozzia, nasce dall’iniziativa di Matteo Montagna e Davide Sassi. Il progetto, per la verità piuttosto ambizioso, punta ad ottenere un frammento di circa 650 paia di basi del gene codificante per la citocromo ossidasi I per tutte le specie di crisomelidi presenti nell’area mediterranea. In tal modo ci si propone di realizzare uno strumento in grado di identificare a livello specifico individui adulti, stadi preimaginali e frammenti di campioni biologici. Questi dati consentirebbero inoltre l’identificazione di criptospecie non rilevabili morfologicamente e, in prospettiva, allorché le pratiche di laboratorio e la tecnologia consentiranno analisi molecolari di routine, l’identificazione della specie di appartenenza anche in assenza di conoscenze specialistiche. Quest’ultima opzione è oggetto, come è noto, di pareri controversi ed è a volte animosamente avversata. Senza entrare nel merito di questa discussione, peraltro assolutamente prematura allo stato attuale delle tecnologie disponibili, ci limitiamo a prendere atto dell’esistenza di questa proposta operativa, riservandoci di approfondirne lo studio dell’effettiva praticabilità. I dati ottenuti, inoltre permetterebbero di ottenere preziose informazioni sulla variabilità genetica intraspecifica (analizzando campioni provenienti da diverse località dell’areale della specie), sulle dinamiche evolutive e sui tempi di speciazione dei taxa analizzati.
        Un’ulteriore possibilità prevista nell’ambito del progetto C-Bar, piuttosto innovativa anche nell’ambito delle rivoluzionarie applicazioni della biosistematica molecolare, è la raccolta di dati molecolari del contenuto intestinale degli esemplari “barcodati”. In tal modo si potrebbe ottenere una straordinaria quantità di informazioni sulle piante ospiti effettivamente appetite, incrementando di molto le modeste conoscenze sulla biologia della quasi totalità delle nostre specie. Infine, i dati raccolti possono essere utilizzati nei censimenti sulle faune di un determinato ecosistema o di intere nazioni, oltre che impiegati in studi di biogeografia per definire e/o completare informazioni sugli areali delle specie ed eventualmente apportare nuove conoscenze sulla fenologia.
        L’approccio in uso presso il Laboratorio di Entomologia Molecolare (L.E.M. DIPSA, Università degli Studi di Milano) prevede l'integrazione tra la tassonomia tradizionale basata sulla morfologia (grazie alla presenza nel gruppo di lavoro di tassonomi specialisti) e il supporto molecolare fornito dall’analisi della variabilità genetica intraspecifica a livello della citocromo ossidasi I. Gli esemplari raccolti durante le campagne naturalistiche e preservati in alcool assoluto per la successiva estrazione degli acidi nucleici sono corredati delle informazioni di raccolta (data di raccolta, località, latitudine, longitudine, altitudine, raccoglitore ed eventuali note ecologiche). Dal momento che l’approccio molecolare non vuole e non può sostituire il tradizionale studio morfologico, ma deve accompagnarsi ad esso integrandone le informazioni, l’estrazione del DNA viene effettuata attraverso una tecnica che conserva praticamente integri i tessuti sclerificati degli insetti. In seguito gli esemplari vengono preparati a secco e conservati nelle raccolte del L.E.M. DIPSA per tutti i necessari confronti. I dati molecolari utilizzati nella ricerca sono depositati all’interno del database BOLD ed NCBI e, una volta pubblicati, saranno liberamente utilizzabili da qualsiasi utente registrato.
        Ad oggi, al termine della fase preliminare dello studio,si sono ottenute sequenze molecolari per 582 campioni appartenenti a 208 specie (vedi elenco) provenienti da diverse località dell’area mediterranea (Italia, Francia, Tunisia, Grecia, Turchia). Sono attualmente in fase di processamento ulteriori 178 campioni (32 specie). Entro l’estate del 2012 la banca dati comprenderà dunque sequenze appartenenti a 240 taxa con un minimo di 4 esemplari analizzati provenienti da diverse località dell’areale.
        Il progetto non prevede ad oggi una data di chiusura. Pur essendo a scadenza la collaborazione del consorzio BOLD, abbiamo in programma di proseguire ad oltranza le ricerche e di impegnarci per il reperimento dei fondi necessari alla conduzione delle onerose tecniche di laboratorio.


        Come partecipare all’iniziativa
        L’iniziativa di ampio respiro in cui siamo coinvolti necessita di aiuto nella raccolta degli esemplari provenienti da diverse località, sia per aumentare il numero di specie processate all’interno della banca dati sia per avere una buona rappresentanza della variabilità genetica intraspecifica analizzando esemplari di diversa provenienza. La collaborazione, anche saltuaria, di amici e colleghi entomologi è dunque non solo auspicabile, ma di fatto indispensabile per la buona riuscita del progetto. Invitiamo pertanto i tanti disponibili entomologi presenti sul territorio nazionale e non a considerare la possibilità di fornire un prezioso apporto al progetto attraverso la raccolta di materiale.

        Se sei interessato a collaborare
        contatta Matteo Montagna (matteomontagna@hotmail.com) o Davide Sassi (davidesassi14@gmail.com) e ti invieremo il kit del DNA barcoder (provette, pinzette ed etanolo assoluto per lo stoccaggio dei campioni) e il manuale per la raccolta dei campioni. Anche pochi esemplari di specie relativamente comuni possono essere molto interessanti se provenienti da zone di cui abbiamo pochi campionamenti. Per questo motivo chiunque è in grado di fornire un contributo davvero importante.


        Ringraziamenti
        Nell’occasione cogliamo l’opportunità di ringraziare pubblicamente gli amici che già in passato hanno fornito interessantissimo materiale, e cioè Fernando Angelini, Maurizio Bollino, Andrea Carlin, Juan de la Rosa, Francesco Izzillo, Carlo Leonardi, Gianluca Magnani.


        Bibliografia

        Herbert PDN, 2005. The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy. Systematic Biology, 54: 852-859.
        Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR, 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci, 270: 313-321.
        Hebert PD, Ratnasingham S, deWaard JR, 2003b. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci, 270 Suppl 1: S96-S99.
        Will KW, & Rubinoff D, 2004. Myth of the molecule: DNA barcodes for species cannot replace morphology for identification and classification. Cladistics 20: 47–55.
        Kubisz D, Kajtoch L, Mazur MA, Rizun V, 2012. Molecular barcoding for central-eastern European Crioceris leaf-beetles (Coleoptera: Chrysomelidae). Cent Eur J Biol, 7:69-76

specie processate al  17 marzo 2012

Agelastica alni
Altica brevicollis
Altica lythri
Altica oleracea
Altica pusilla
Aphthona cyparissiae
Aphthona flava
Aphthona herbigrada
Aphthona lutescens
Aphthona nonstriata
Aphthona sp.
Aphthona sp.
Argopus ahrensii
Arima marginata
Arrhenocoela lineata
Bruchus sp.
Bruchus sp.
Bruchus sp.
Calomicrus circumfusus
Calomicrus sp.
Cassida algirica
Cassida alpina
Cassida denticollis
Cassida ferruginea
Cassida inopinata
Cassida inquinata
Cassida margaritacea
Cassida prasina
Cassida rubiginosa
Cassida sanguinolenta
Cassida subreticulata
Cassida vibex
Cassida viridis
Chaetocnema conducta
Chaetocnema hortensis
Chrysochus asclepiadaeus
Chrysolina americana
Chrysolina fastuosa
Chrysolina graminis
Chrysolina haemoptera
Chrysolina herbacea
Chrysolina polita
Chrysolina rossia
Chrysolina sp.
Chrysolina sturmi
Chrysolina varians
Chrysolina viridana
Chrysomela populi
Chrysomela vigintipunctata
Clytra laeviuscula
Clytra quadripunctata
Colaspidea sp.
Colasposoma sp.
Coptocephala scopolina
Coptocephala sp.
Crepidodera aurata
Crepidodera aurea
Crepidodera fulvicornis
Crepidodera lamina
Crepidodera plutus
Cryptocephalus albzorensis
Cryptocephalus aquitanus
Cryptocephalus aureolus
Cryptocephalus bameuli
Cryptocephalus barii
Cryptocephalus biguttatus
Cryptocephalus bilineatus
Cryptocephalus bimaculatus
Cryptocephalus bipunctatus
Cryptocephalus blanduloides
Cryptocephalus cantabricus
Cryptocephalus chrysopus
Cryptocephalus connexus
Cryptocephalus convergens
Cryptocephalus cordiger
Cryptocephalus cristula
Cryptocephalus cyanipes
Cryptocephalus czwalinae
Cryptocephalus dumonti
Cryptocephalus elegantulus
Cryptocephalus eridani
Cryptocephalus flavipes
Cryptocephalus fulvus
Cryptocephalus globicollis
Cryptocephalus hennigi
Cryptocephalus hypochaeridis
Cryptocephalus imperialis
Cryptocephalus informis
Cryptocephalus janthinus
Cryptocephalus labiatus
Cryptocephalus leonhardi
Cryptocephalus loreyi
Cryptocephalus marginatus
Cryptocephalus marginellus
Cryptocephalus mariae
Cryptocephalus molossus
Cryptocephalus moraei
Cryptocephalus nitidus
Cryptocephalus ocellatus
Cryptocephalus octoguttatus
Cryptocephalus pini
Cryptocephalus primarius
Cryptocephalus pusillus
Cryptocephalus pygmaeus
Cryptocephalus pygmaeus vittula
Cryptocephalus quadripunctatus
Cryptocephalus renatae
Cryptocephalus rugicollis
Cryptocephalus samniticus
Cryptocephalus scapularis
Cryptocephalus sericeus
Cryptocephalus sexpunctatus
Cryptocephalus signatifrons
Cryptocephalus strigosus
Cryptocephalus tetraspilus
Cryptocephalus therondi
Cryptocephalus transcaucasicus
Cryptocephalus transiens
Cryptocephalus trimaculatus
Cryptocephalus turcicus
Cryptocephalus variegatus
Cryptocephalus violaceus
Cryptocephalus violaceus scaffaiolus
Cryptocephalus vittula
Cryptocephalus zoiai
Derocrepis rufipes
Derocrepis sodalis
Diabrotica virgifera
Dibolia sp.
Dicladispa testacea
Donacia brevitarsis
Donacia crassipes
Donacia obscura
Entomoscelis rumicis
Epitrix pubescens
Exosoma lusitanicum
Exosoma sp.
Galeruca laticollis
Galeruca pomonae
Galeruca sp.
Galeruca tanaceti
Galerucella lineola
Galerucella nymphaeae
Galerucella pusilla
Gastrophysa viridula
Gonioctena quinquepunctata
Gonioctena sp.
Hermaeophaga mercurialis
Hippuriphila modeeri
Hispa atra
Hypocassida cornea
Hypocassida subferruginea
Labidostomis longimana
Labidostomis sp.
Labidostomis sp.
Labidostomis taxicornis
Lachnaia italica
Lema cyanella
Lilioceris merdigera
Linaeidea aenea
Lochmaea caprae
Lochmaea crataegi
Longitarsus aeneicollis
Longitarsus apicalis
Longitarsus exoletus
Longitarsus luridus
Longitarsus melanocephalus
Longitarsus pinguis
Longitarsus refugiensis
Longitarsus sp.
Longitarsus succineus
Luperus flavipes
Luperus leonardii
Luperus longicornis
Luperus luperus
Luperus sp.
Luperus viridipennis
Lythraria salicariae
Macrolenes dentipes
Melasoma populi
Neocrepidodera cyanipennis
Neocrepidodera ferruginea
Neocrepidodera melanostoma
Neocrepidodera peirolerii
Neocrepidodera sp.
Neocrepidodera transversa
Nimphius sp.
Oomorphus concolor
Oreina bifrons
Oreina cacaliae
Oreina elongata
Oreina liturata
Oreina sp.
Oreina sp.
Oreina sp.
Oreina speciosa
Oreina speciosissima
Oreina virgulata
Orsodacne cerasi
Orsodacne variabilis
Oulema melanopus
Oulema duftschmidi
Pachybrachis burlinii
Pachybrachis exclusus etruscus
Pachybrachis hieroglyphicus
Pachybrachis hippophaes
Pachybrachis karamani
Pachybrachis sp.
Pachybrachis sp.
Pachybrachis tessellatus
Phaedon cochleariae
Phratora vitellinae
Phyllotreta ochripes
Phyllotreta sp.
Phyllotreta vittula
Plagiodera versicolora
Plateumaris consimilis
Podagrica malvae
Prasocuris phellandrii
Psylliodes affinis
Psylliodes brisouti
Psylliodes dulcamarae
Psylliodes gibbosus
Psylliodes kuntzei
Psylliodes sp.
Psylliodes thlaspis
Sermylassa halensis
Smaragdina affinis
Smaragdina chloris
Smaragdina concolor
Smaragdina flavicollis
Smaragdina limbata
Smaragdina salicina
Smaragdina sp.
Sphaeroderma rubidum
Sphaeroderma testaceum
Stylosomus minutissimus
Timarcha latipes
Timarcha nicaeensis
Tituboea biguttata
Tituboea sp.
Tituboea sp.